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Whole Genome-Analyse zur Detektion Azolresistenz-charakteristischer genetischer Veränderungen und Antimykotika-Resistenz-vermittelnder Mutationen im cyp51A-, FKS1-, ERG3-, Wsc1-, hapE- und cdr1B-Gen von Aspergillus fumigatus aus Isolaten

Projektleiter: Prof. Dr. med. Dieter Buchheidt
III. Medizinische Klinik, Universitätsmedizin Mannheim
 

Erweiterter Titel: Whole Genome-Sequenzierung des Aspergillus fumigatus-Genoms aus Azol-resistenten und nicht-resistenten Isolaten zur Detektion von neuen und beschriebenen Mutationen in den Gesamt-Gensequenzen der Gene cyp51A (ERG 11), FKS1, ERG3, Wsc1, hapE und cdr1B, und zur Definition von charakteristischen genetischen Veränderungen die bei Aspergillus fumigatus eine Resistenz gegen Triazol- und Echinocandin-Antimykotika bedingen, zur Optimierung der Therapie systemischer Pilzinfektionen bei Patienten mit akuten Leukämien sowie epidemiologische Untersuchungen zur Mutationsprävalenz

Die Inzidenz durch Pilze hervorgerufener lebensbedrohlicher Infektionen ist im Vergleich zu bakteriellen Infektionen zwar niedriger, es wird jedoch etwa seit Anfang der siebziger Jahre eine ansteigende Tendenz schwerer systemischer Pilzinfektionen, speziell bedingt durch Aspergillus-Spezies, beobachtet. Patienten mit langdauernden Neutropenie-Phasen nach intensiver Chemotherapie, insbesondere Patienten mit akuten Leukämien in der Induktionstherapie und nach allogener Blutstammzell- oder Knochenmarktransplantation, haben ein sehr hohes Risiko, an systemischen Pilzinfektionen, in erster Linie bedingt durch Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), zu erkranken; die infektionsbedingte Sterblichkeit ist bei dieser Patientengruppe immer noch hoch; an vielen Blutstammzelltransplantationszentren sind systemische Pilzinfektionen mit Aspergillus fumigatus die häufigste tödlich verlaufende Infektion, trotz aller Bemühungen um eine Verbesserung der Prophylaxe, der Diagnostik und Therapie. Gerade bei diesen mit hoher Mortalität oder Morbidität einhergehenden schweren Infektionen stehen nur wenig sensitive diagnostische und nur relativ wenige therapeutische Möglichkeiten mit suboptimalen Ansprechraten zur Verfügung; trotz frühzeitiger empirischer oder präemptiver Einleitung einer systemischen antimykotischen Therapie ist in dieser Patientengruppe ein Therapieversagen nicht ungewöhnlich.

Neben der dringenden Notwendigkeit einer Verbesserung der frühzeitigen Diagnostik invasiver Aspergillus-Infektionen ist es auch von zunehmender klinischer Relevanz, Resistenzmechanismen gegen Antimykotika nachzuweisen, um die spezifische Behandlung zu optimieren.

Nach einem vor bereits mehr als 20 Jahren etablierten und in klinischen Studien mehrfach validierten Aspergillus-PCR-Assay zur Diagnostik einer invasiven Aspergillus-Infektion bei hämatologischen Hochrisikopatienten entwickelte und etablierte unsere Arbeitsgruppe die weltweit ersten molekularbiologischen Tests, die die global häufigsten genomischen Veränderungen mit hoher Sensitivität und Spezifität -nicht-kulturbasiert- direkt an klinischem Material detektieren, die eine Triazol-Resistenz bei Aspergillus fumigatus bewirken; die Triazole Voriconazol bzw. Posaconazol sind die am häufigsten eingesetzten Antimykotika zur Therapie bzw. Prophylaxe invasiver Aspergillus-Infektionen bei Patienten mit akuten Leukämien. Nicht-kulturbasierte Diagnostik- und Azol-Resistenz-Assays sind in diesem Szenario von besonderer Bedeutung, da die Sensitivität des kultur-basierteren Nachweises des Erregers bei hämatologischen Patienten lediglich etwa 25 % beträgt.

Nach der Publikation der Methode und erster klinischer Daten im Jahr 2012 sowie der ersten Kasuistiken von Patienten, bei denen mit unseren PCR-Assays sowohl eine Aspergillus-Infektion über den PCR-basierten Nachweis genomischen Materials des Erregers direkt in klinischen Proben als auch eine Azol-Resistenz-Konstellation nachgewiesen worden war, wurden 2014 von unserer Arbeitsgruppe die Daten einer retrospektiv-epidemiologischen Studie zu dieser Thematik publiziert. Eine prospektive, multizentrische, offene Diagnostik-Studie zur weiteren Klärung epidemiologischer Zusammenhänge und zur Evaluation der klinischen Relevanz des Nachweises von Azol-Resistenz ist abgeschlossen und wird aktuell ausgewertet.

Ziel des beantragten Projektes ist zunächst die molekularbiologisch-genotypische Detektion von Mutationen bei kulturell-phänotypisch charakterisierten Aspergillus-Stämmen, die Resistenzen gegen standardmäßig eingesetzte Triazol- und Echinocandin-Antimykotika bewirken, darunter beschriebene, klinisch relevante Mutationen im 14?-Sterol-Demethylase- (cyp51A/cyp51B/ERG11)-, ?-1,3-Glucan-Synthase (FKS1)-, C-5-Sterol-Desaturase (ERG3)-, Cell-Wall-Surface-Sensor (Wsc1)- sowie im CCAAT-binding factor complex subunit (hapE)- und im Efflux-Transporter (cdr1B)-Gen. Darüber hinaus sollen Gene, die für weitere Proteine im Ergosterol-Biosynthese-Pathway des Erregers kodieren, sowie Gene aus dem Komplex 1 des Glykolyse-Stoffwechsels (Triosephosphat-Isomerase) und aus dem Glyzerophosphat-Shuttle des mitochondrialen Stoffwechsels (29 KD NADH Dehydrogenase) auf das Vorliegen bislang nicht bekannter Mutationen hin untersucht werden;

Nachdem bislang vorwiegend einzelne Azol-Resistenz-bedingende Mutationen im cyp51A Gen bei Aspergillus fumigatus molekularbiologisch nachgewiesen wurden, ist der Ausgangspunkt für den vorliegenden Antrag eine Next Generation Sequencing (NGS)-basierte, in unserem Labor bereits etablierte Methode zur Analyse des kompletten Genoms von Aspergillus fumigatus durch Whole Genome-Sequenzierung. Zunächst sollen Mutationen in den beschriebenen Genen aus 15 kulturell charakterisierten Aspergillus fumigatus-Isolaten nachgewiesen werden. Um genetische Resistenzmuster des Erregers über Whole Genome-Sequenzierung zu detektieren und zu charakterisieren, werden Isolate mit auffälligem Resistogramm (Resistenz gegen Azole oder Echinocandine) molekularbiologisch-genotypisch untersucht und die Befunde hinsichtlich bekannter wie neu detektierter Mutationen in Korrelation gebracht. Möglicherweise lassen sich damit neue und letzlich prognostisch relevante Antimykotika-Resistenz-spezifische genetische Muster definieren, ähnlich der für Mycobacterium tuberculosis beschriebenen nicht-kulturbasierten molekularbiologischen Suszeptibilitätstestung.

Die Detektion bekannter und neuer Resistenz-verursachender Mutationen bei Aspergillus fumigatus durch molekularbiologische Methoden könnte auf klinischer Seite die Auswahl effektiver, spezifischer Antimykotika erleichtern, zur Reduktion der Dauer und der Toxizität der antimykotischen Therapie und zur Vermeidung von empirischen Übertherapien beitragen und letztlich, durch eine Optimierung der antimykotischen Therapie, zu einer Verbesserung der Prognose von neutropenischen Patienten mit akuten Leukämien nach intensiver Chemotherapie oder allogener Blutstammzelltransplantation führen. 

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